倪士奇在《自序》中将自家的医业相继与龙门司马迁家世代执太史业相比堪。其祖父倪龙山曾遇异人传授针灸之术，其父倪小龙行医淮海也誉满当地，之后定居扬州。倪士奇兄三人，兄倪士英、弟倪士彦以医为业。

倪士奇自幼习儒，曾游泮宫。但他在十二岁时的一次偶然，竟显示出具有明医悟性的资质。当年，乃父的友人因家中有病人前来延医，倪士奇在父亲外出的情况下，居然询问病情后，断为阳明经证，投大柴胡汤以济急，病家也略通医学，取仲景书阅之契符，遂用药一剂而愈。经此事后，倪士奇有不为良相愿为良医之志。又特到关帝庙求卜也应合。此后以八年时间读《素问》等医经和百家秘典。其父仙逝后便转归京口行医十九年。在天启元年，因治好大司空王公奇的病而被推荐进京，在武英殿任秘书之职十年，于崇祯三年出京南游数处名胜之地，又在南京行医六年，之后又回老家镇江行医著书。

倪士奇著有《两都医案》，共两卷。成书于明崇祯十七年（1644）。全书共载医案72则，其中南案31则，北案41则，皆系疑似难解之症，包括痰厥、痰滞、下痢、中风、难产、阳痿、不育等病。案中详究病机，辨别疑难，因病施方，针药并用，其中治痈善用针刺之法颇有特色。